细胞支原体污染是什么状态

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支原体检测的背景

由于细胞支原体污染的隐蔽性及对细胞的严重影响,细胞的支原体污染已经成为了一个比较棘手的世界性难题。实验室新引进的细胞,应该比较采取一定的方法检疫确定没有支原体污染才能使用。为了提高动物细胞培养生物制品的质量和安全性,中华人民共和国药典规定主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞应进行支原体检测。美国食品药品监督管理局(FDA)强烈建议,应该用合适的方法检测细胞的支原体污染状况。欧洲药典European Pharmacopoeia(EP,7 the dition,Section2.6.7.)规定对细胞治疗产品需要进行严格的支原体检测。提高对支原体污染的警惕,坚持定期做支原体的检测,努力杜绝污染。所以寻找一种快速简单灵敏的方法进行细胞支原体常规检测就显得尤为重要。

支原体的定义

支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(0.1-0.3µm),并独立生活的原核细胞型微生物,无细胞壁,多呈不规则球状、长丝状,可分枝。分布广,种类多,80余种。具有以下特点:

●可以通过0.22µm 和0.45 µm 孔径的滤膜

●可以自我复制

●无细胞壁,有简单的质膜

●有潜在的致病性:如人呼吸道疾病

●有很强的适应环境的能力,但对环境的化学变化敏感

●有青霉素、头孢菌素、链霉素抗性(由于青霉素、头孢的作用位点是细胞壁)。对四环素、大环内酯类、喹诺酮类敏感 。

支原体放行检测的金标准

在生物药和细胞治疗领域,支原体检测必不可少,它是避免外源因子污染,保证产品质量的重要质控手段。

我国药典规定,如下领域需要进行支原体检测:

包括主细胞库、工作细胞库、生产终末细胞、检定细胞、病毒种子批和病毒收获液、细胞培养相关材料如培养基、胰酶、临床治疗用干细胞和免疫细胞、

新生牛血清以及杂交瘤细胞等。

我国药典规定的支原体检测方法为培养法和指示细胞染色法。但这些方法也存在一些不尽人意之处,如所需时间较长,有的操作复杂等。2017年我国药品监督管理局发布了《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》,其中提到,基于细胞治疗药物的特点,申请人可以开发新型的支原体检测方法进行放行检测,但是检测方法应经过充分验证。即,只要经过充分验证,新型支原体检测方法是可以替代药典方法的。2018年中国医药生物技术协会联合业内专家,也起草发布了《嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T细胞)制剂制备质量管理规范》,里面同样提到,CAR-T细胞制剂质制备后需立即进行回输,可采用经过验证的快速检测方法。其中,每批次的CAR-T细胞制剂放行检测项目也包括支原体检测。

检测方法

1、培养法

2、DNA荧光染色法

3、PCR(Polymerase Chain Reaction)检测支原体方法

4、荧光定量PCR

5、环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)

6、ATP酶法

7、恒温扩增技术

8、ERA恒温核酸扩增技术

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